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Wednesday 13th of December 2017

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NUOVE PROSPETTIVE DI UTILIZZO DEL NEEM CAKE
COME LARVICIDAPER LA LOTTA A NUOVI INSETTI VETTORI
IMPORTANTI PER LA SICUREZZA ZOOTECNICA IN ITALIA

S.Mariani, A.D’Andrea

Da ENEA - Dipartimento BAS Biotecnologie,

 Agroindustria e Protezione della Salute per Neem Italia


RIASSUNTO: La presente relazione illustra i risultati conseguiti testando l’attività larvicida
su zanzara tigre di estratti ottenuti dal neem cake. Nella prima parte della relazione verranno
fornite informazioni sul neem cake, sottoprodotto di scarto dei processi industriali di
produzione dell’olio di Neem (Azadirachta indica A. Juss.) dai semi della pianta.
Successivamente verranno descritti test dell’attività insetticida del neem cake testata su
zanzara tigre (Aedes albopictus Skuse, Diptera: Culicidae). I promettenti risultati indicano la
possibilità di utilizzare il neem cake come base per lo sviluppo di nuovi bio-insetticidi di facile
utilizzo, eco-compatibili, sicuri e ottenuti da fonti rinnovabili.

INTRODUZIONE

Numerosi sono gli studi stati fatti su foglie e frutti del’albero del neem (Azadirachta indica A. Juss.) (Mulla and Su 1999 , Siddiqui et al. 2003, Wandscheer et al. 2004) e recenti ricerche confermano che l’olio di neem può essere usato come un larvicida alternativo rispetto ai più tradizionali pesticidi (Awad and Shimaila 2003). E’ stato dimostrato che l’azadiractina e l’olio di neem possono agire come larvicidi nella lotta contro zanzare. (Naqvi et al., 1991; Amorose, ­1995; Sagar&Sehgal, 1996; Mulla et al., 1997; Okumu et al., 2007). In India è stato anche sperimentato l’uso del sottoprodotto del processo di estrazione dell’olio (neem cake) per combattere l’infestazione di zanzare del genere Culex nelle risaie (Rao et al., 1992). L’EPA, Enviromental Protection Agenzy, ha registrato la Diidroazadirachtina e la Azadirachtina, estratte dalla pianta del Neem, con nome commerciale DAZA da utilizzare, oltre che come insetticida, anche come nematocida in agricoltura. L’EPA dal punto di vista tossicologico conclude che, grazie alla bassa tossicità dei derivati del Neem, vi è una ragionevole sicurezza di non rischio per l’esposizione di una popolazione a queste molecole (contaminazione nella dieta, nell’acqua, altre fonti). Oggetto di questa relazione è quindi lo studio e lo sviluppo, dal neem cake, di un nuovo prodotto con attività bio-insetticida per la lotta alla zanzara tigre, Aedes albopictus ( Skuse, 1894) ed in particolare lo studio degli effetti tossici , sulle uova e larve dell’insetto, di frazioni derivate dal neem cake.

Il neem cake e i processi di estrazione

L’olio di neem è ottenuto mediante l’estrazione a freddo dei semi e dei frutti puliti e raccolti a mano. L’estrazione denominata “cold pressed”, spremitura a freddo, costituisce il più vecchio metodo di estrazione, produce l’olio di migliore qualità e si realizza con apparecchiature meccaniche che spremono l’olio dai semi. Il rendimento in olio è variabile dal 20 al 30% ed il neem-cake è il residuo del processo di estrazione. Un secondo processo di estrazione utilizza il vapore ad alta pressione. Benché si ottenga una maggiore resa in olio rispetto alla spremitura a freddo, molti dei composti attivi sono deteriorati a causa delle temperature estreme. ll terzo metodo consiste nell’estrazione con n-esano e permette di ottenere grandi quantità di olio di buona qualità. In genere questo processo viene applicato sul residuo dell’estrazione a freddo e l’olio che si ottiene viene utilizzato come materia prima nell’industria del sapone per le sue proprietà anti-fungine, anti-batteriche e dermatologiche. Sul mercato sono presenti quindi 2 tipi di neem cake:

  • neem oil cake : è il prodotto che si ottiene dalla lavorazione durante la fase di spremitura a freddo. Il contenuto di olio residuo nel cake è del 6% circa.

  • neem de-oiled cake: è il prodotto di lavorazione ottenuto dal processo di estrazione con solvente organico. Il contenuto di olio in questo tipo di neem cake è del 1.5 %.

Il neem cake viene utilizzato come ammendante, fertilizzante naturale, condizionatore del suolo; inoltre aumenta l’efficacia dei fertilizzanti azotati minimizzando i costi di applicazione ed è attivo contro i nematodi del terreno proteggendo le radici delle piante.
L’idea di sviluppare nuovi bio-insetticidi dal neem cake presenta i seguenti elementi di novità.
Efficacia: gli studi condotti hanno dimostrato che il neem cake possiede un’elevata attività larvicida rispetto a larve di Aedes albopictus; inoltre i trattamenti a base di derivati della Azadichta indica sono compatibili con il Bacillus thurigiensis.
Basso costo: il neem cake è una matrice vegetale largamente disponibile e a basso costo nel mercato italiano e mondiale, poiché è il sottoprodotto di una filiera industriale consolidata.
Sostenibilità: il neem cake è un residuo vegetale rinnovabile derivante dal processamento dei semi che costituiscono una parte rinnovabile della pianta.
Composizione chimica: il neem cake è un prodotto di composizione chimica molto interessante e complessa ricco di molecole con attività insetticida non sintetizzabili chimicamente.
Salubrità: il neem cake è un prodotto di origine naturale sicuro in relazione al fatto che deriva da una pianta utilizzata da millenni nella tradizione erboristica indiana.
Disponibilità commerciale: il neem cake è un prodotto che attualmente viene già commercializzato poiché viene utilizzato in agricoltura come ammendante del terreno e in zootecnia come sfarinato da aggiungere nei mangimi zootecnici.
Facilità di utilizzo: il neem cake è un prodotto non tossico per gli organismi superiori, può essere maneggiato senza particolari precauzioni e quindi è particolarmente indicato per utilizzo domestico.
Tutela dell’ambiente: il neem cake è un prodotto utile per la tutela dell’ambiente in quanto l’ Azadirachta è considerata pianta chiave per la lotta alla desertificazione nelle aree tropicali e subtropicali di tutto il mondo.
La possibilità di usare il neem cake come materia prima per produrre un nuovo bio-insetticida botanico può rappresentare una ulteriore valorizzazione di questa pianta.

Zanzara tigre

La zanzara tigre è un insetto particolarmente nocivo a livello cittadino perché provoca fastidiose punture anche nelle ore diurne e può essere vettore di molte patologie in campo medico e veterinario. In Emilia Romagna sono stati registrati casi di animali infetti da West Nile virus ed sono emerse patologie trasmesse da questa zanzara quali il Dengue e la Chikungunya
I siti riproduttivi di questa zanzara sono rappresentati da piccole raccolte di acqua di origine antropica; i trattamenti insetticidi realizzati dai Comuni, trattando solo i tombini presenti nelle strade cittadine e nelle aree pubbliche, non controllano i focolai larvali che si trovano nelle aree private. Con l’obiettivo di trattare tutte le piccole raccolte d’acqua presenti nelle proprietà private quali balconi, cortili e giardini, numerosi Comuni dell’Emilia Romagna hanno iniziato la distribuzione gratuita di insetticidi con attività larvicida ai privati. Generalmente viene distribuito per uso domestico un preparato a base di Bacillus thurigiensis varietà israeliensis che però è inefficace in ambienti acquosi ricchi di sostanza organica quali i tombini stessi. Il Temenphos, insetticida ad azione larvicida di tossicità più elevata, viene utilizzato soltanto dalle ditte specializzate in disinfestazioni incaricate dai Comuni.

MATERIALI E METODI
Materiale botanico: è stato utilizzato il neem cake prodotto commercialmente del tipo ottenuto attraverso il processo di spremitura afreddo.

Processo di frazionamento del neem cake : Il neem cake (3 Kg) è stato estratto con MeOH a temperatura ambiente 2 volte al giorno per 2 giorni ottenendo, dopo l’evaporazione del solvente, 49 g di estratto secco. L’estratto metanolico è stato trattato con n-esano ottenendo per filtrazione la frazione di esano (Hp), nella quale erano contenuti i composti più lipofili.La parte residua è stata disciolta in una miscela di eguali quantità di acqua e EtOAc (1L) ,ottenendo 2 fasi , la seconda frazione organica (Ep 22g) e una frazione acquosa (W). A quest’ultima è stata addizionata una eguale quantità di n-BuOH ottenendo la terza frazione organica (Bp 5g) e una frazione acquosa finale (Wp).Tutte le frazioni sono state sottoposte ai test per l’attività biologica ed esaminate attraverso analisi HPLC. In seguito ai risultati ottenuti dai test biologici è stata selezionata la frazione Ep per via della maggiore attività. Il composto più abbondante, è risultato essere la salannina.

Metodo di analisi dei campioni con tecnica HPLC

Per le analisi quantitative dei metaboliti (Azadiractina A, Azadiractina B Salannina, Nimbina) negli estratti è stata usato:HPLC della Perkin Elmer con pompa a due solventi PE Serie 200; loop 20 μL; rivelatore UV-VIS 785A; interfaccia PE Nelson-Network Chromatography Interface NCI; una colonna Restek C 18 II pinnacle 5 μm, 250x46. Programma: flusso 1,00 mL/min; 8 min ISO 45% CH3CN; 22 min GRA 100% CH3CN; 10 min ISO 100% CH3CN;

λriv = 214 nm. Per le analisi quantitative sono state preparate le curve di calibrazione per ogni metabolita analizzato, utilizzando 5 soluzioni standard nel range di concentrazione compreso tra 1 e 10 ppm.

RISULTATI E CONCLUSIONI
Risultati Test Biologici

L’attività delle soluzioni trattate su Aedes albopictus sono mostrati nelle tabelle.Le tabelle 1, 2, 3 mostrano che le soluzioni trattate non esercitano attività sulla schiusa di uova che hanno completato in modo naturale lo sviluppo embrionale. Tali uova, immerse al V° giorno di età nelle soluzioni trattate, schiudono senza sostanziali differenze nelle soluzioni trattate e nei controlli.
Le tabelle 1, 2, 3 mostrano che le soluzioni trattate causano una significativa mortalità larvale. La mortalità delle larve nate nelle soluzioni trattate è stata registrata dopo 2, 4, 6, 8 giorni.
All’8° giorno le frazioni Ep e Hp (Tab.1) hanno mostrato una mortalità larvale significativamente più elevata rispetto al controllo e alla frazione Bp e Wp.

Tab.1 – Attività degli estratti di neem cake su uova e larve di Aedes Albopictus .

 

Campioni

 

Schiusa media

(% ± DS)¹

 

Mortalità media (% ± DS)¹

 

Dopo 2 giorni

Dopo 8 giorni

controllo(H2O)

63.33 ± 21.86 a

6.90 ± 6.20 a

6.90± 6.20a

Bp

53.33 ± 5.77 a

6.67 ± 11.55 a

6.67 ± 11.55 a

Wp

43.33 ± 14.53 a

2.22 ± 3.85 a

15.56 ± 26.94 a

Ep

36.67 ± 14.53 a

4.95 ± 4.29 a

86.94 ± 5.17 b

Hp

35.56 ± 18.95 a

3.70 ± 6.42 a

88.78 ± 5.39 b

¹)Lettere differenti sulla stessa riga orizzontale indicano differenze significative nel tasso di schiusa e di mortalità delle larve (Test di Tukey 0.05)

La soluzione Ep (50 ppm dell’estratto) è stata scelta rispetto alla soluzione Hp per il minor contenuto in acidi grassi.
All’8 giorno la frazione Ep ha mostrato lo stesso effetto (Tab. 2), in termini di mortalità larvale, della soluzione tecnica di Azadiractina (Az_A 10 ppm) .

Tab.2 – Attività di Ep e di soluzioni azadiractina tecnica a varie concentrazioni, su uova e larve di Aedes albopictus.

 

Campioni

 

Schiusa media

(% ± DS)¹

 

Mortalità media (% ± DS)¹

 

Dopo 2 giorni

Dopo 8 giorni

control (H2O)

63.33 ± 21.86 a

6.90 ± 6.20 a

6.90 ± 6.20a

Az_A 0.1 ppm

44.44 ± 1.92 a

2.56 ± 4.44 a

10.26 ± 17.76 a

Az_A 0.5 ppm

55.33 ± 14.53 a

3.17 ± 5.50 a

3.17 ± 5.50 a

Az_A 1.0 ppm

47.78 ± 15.75 a

0,0 ± 0,0 a

5.79 ± 5.57 a

Az_A 5.0 ppm

54.44 ± 5.09 a

0.0 ± 0.0 a

27.69 ± 18.22 a

Az_A 10.0 ppm

48.89 ± 6.94 a

13.21± 5.06 b

80,49 ± 10.99 b

Ep

36.67 ± 14.53 a

4.95 ± 4.29 a

86.94 ± 5.17 b


¹)Lettere differenti sulla stessa riga orizzontale indicano differenze significative nel tasso di schiusa e di mortalità delle larve (Test di Tukey 0.05)

All’8 giorno la frazione Ep ha mostrato lo stesso effetto (Tab. 3), in termini di mortalità larvale della soluzione di Diractin (Tab. 3) a Az 10-100-1000 ppm.
Tab.3 – Attività di Ep e di soluzioni azadiractina commerciale, a varie concentrazioni, su uova e larve di Aedes albopictus.

 

 

Campioni

 

Schiusa media

(% ± DS)¹

 

Mortalità media (% ± DS)¹

 

Dopo 2 giorni

Dopo 8 giorni

controllo (H2O)

28.89 ± 5.09 a

3.70 ± 6.42 a

14.44 ± 17.11 a

Dirachtin (Az 1.0ppm)

24.44 ± 5.09 a

31.75 ± 2.75a

36.51 ± 5.50 a

Dirachtin (Az 10.0ppm)

31.11 ± 1.92 a

22.22 ± 22.22 a

85.56 ± 6.76 b

Dirachtin (Az 100ppm)

27.78 ± 1.92 a

51.85 ± 37.64 a,b

92.13 ± 6.85 b

Dirachtin (Az 1000ppm)

30.0 ± 3.33 a

100.0 ± 0.0 b

100.0 ± 0.0 b

Ep

30.42 ± 12.73 a

3.75 ± 3.89 a

84.34 ± 4.65 b

¹) Lettere differenti sulla stessa riga orizzontale indicano differenze significative nel tasso di schiusa e di mortalità delle larve (Test di Tukey 0.05)

I risultati dei test di attività biologica individuano, quindi, nella frazione Ep, la presenza della migliore attività.
Si è proceduto quindi all’analisi HPLC per la sua caratterizzazione (Fig.1).

Fig. 2 Profilo cromatografico HPLC della soluzione Ep

Le analisi quantitative rivelano la presenza di nortriterpeni, mostrando i seguenti risultati: Az_A (0.7 ppm) , Az_B (0.3 ppm), Sal (1.5 ppm), Nim (0.3 ppm).

L’analisi NMR di questa frazione ha mostrato la presenza di tre componenti principali: a) un acido grasso principale b) varie sostanze policicliche aromatiche, la cui struttura è ancora in via di definizione c) nortriterpeni, evidenziate grazie ai caratteristici segnali dell’ossigenazione.

I risultati ottenuti permettono di considerare il neem cake come promettente materia prima per lo sviluppo di un nuovo bioinsetticida contro la zanzara tigre poiché è stata isolata una frazione molto attiva contro le larve di questo insetto.
E’ stato dimostrato che i prodotti commerciali a base di azadiractina presentano la stessa efficacia solo se utilizzati a concentrazioni 10 volte superiori alla Azadiractina presente nella frazione individuata.
Alla base della spiccata attività insetticida di questa frazione, quindi, vi è l’azione dovuta alla salannina ed alla co-presenza di numerosi composti aromatici (la cui struttura deve essere determinata) e di costituenti di acidi grassi che agiscono come agenti solubilizzanti e stabilizzanti dell’intero fitocomplesso.

BIBLIOGRAFIA

Amorose, T., 1995. Larvicidal efficacy of neem (Azadiractha indica) oil and defatted cake on Culex quinquefasciatus Say. Geobios 22: 169-173.Awad O.M. and A. Shimaila, 2003. Operational use of neem oil as an alternative anopheline larvicide.Part A: laboratory and field efficacy;Operational use of neem oil as an alternative anopheline larvicide.Part B: environmental impact and toxicological potential. WHO Eastern Mediterranean Health Journal 9(4): 637-645.Mulla, M.S., Chaney, J.D. & Fodcharoen J., 1997. Activity and efficacy of neem product against mosquito larvae. Proceeding of International Symposium on Biopesticides (Phitsanouk, Thailand) Bangkok, Thailand: Chulalong University press, pp 149-156.Mulla, M.S. & Su, T., 1999. Activity and biological effects of neem products against arthropods of medical and veterinary importance. Journal of American Mosquitoes Control Association 15(2): 133-1520.Naqvi, S.N., Ahmed S.O. & Mohamed, F.A., 1991. Toxicity and IgR (Insect Regularity Effect) of two neem products against Aedes aegypti (PCSIR Strain). Pakistan Journal of Pharmaceutical Sciences 4(1): 71-76.Okumu, F.O., Knols, B.G.J. & Fillinger, U., 2007. Larvicidal effects of a neem (Azadirachta indica) oil formulation on the malaria vector Anophele gambiae. Malaria Journal 6:63.Rao, D.R., Reuben, R., Venugopal, M.S., Nagasampagi, B.A & Schumetterer H., 1992. Evaluation of neem, Azadiractha indica, with and without water management, for the control of culicine mosquito larvae in rice–fields. Medical Veterinary Entomology 6: 318-324.Sagar, S.K. & Sehgal, S.S., 1996. Effects of acqueous extract of deoiled neem (Azadirachta indica Juss) seed kernel and karanja (Pongamia glabra vent) seed kernel against Culex quinquefasciatus. Journal Communicable Disease 28(4): 260-269. Siddiqui, B.S., Afshan F., Gulzar T., Sultana R., Naqvi N.-H., and Tariq R.M. 2003 Tetracyclic triterpenoids from leaves of azadirachta indicaand their insecticidal activities. Chemical and Pharmaceutical Bullettin 51: 415-417.Wandscheer, C.B., Duque, J.E., da Silva, M.A.N., Fukuyama, Y., Wohlke, J.L., Adelmann, J. & Fontana, J.D., 2004. Larvicidal action of ethanolic extracts from fruit endocarps of Melia azedarach and Azadirachta indica against the denge mosquito Aedes aegypti. Toxicon 8:829-835.

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